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伊藤政博教授の研究グループら、カルシウムイオンで動く世界初の生体ナノマシンの発見

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世界初!カルシウムイオンで動く生体ナノマシンを発見
~オーダーメイド・ナノロボットの創成が期待される~

概要

生命科学部生命科学科の伊藤政博教授と同大学院博士前期課程2年在籍の今澤陸さん、バイオ・ナノエレクトロニクス研究センター研究員の高橋優嘉博士らのグループは、生体ナノマシンとして注目を集めている細菌運動器官のべん毛モーター(※1)で二価の陽イオンを駆動力として利用することができる世界初の生物モーターをもつ微生物(Paenibacillus sp. TCA20株)を鶴巻温泉(神奈川県秦野市(※2))の高濃度のカルシウムイオンを含む温泉水から発見しました。東洋大学生命科学部とバイオナノエレクトロニクス研究センターでは、これまで地球上の様々な過酷な環境から微生物(極限環境微生物(※3))を分離し、その生態および分子生物学的解析とその利用を他の大学に先駆けて積極的に展開してきました。今回の成果は、その現れといえます。
べん毛モーターは、これまでプロトン(H+)、ナトリウムイオン(Na+)、カリウムイオン(K+)といった一価の陽イオンを共役イオンとして駆動すると考えられてきました。しかし、今回、エネルギー源として新たに二価の陽イオンであるカルシウムイオン(Ca2+)やマグネシウムイオン(Mg2+)を利用できる生物モーターの発見は、これまでの常識を覆す研究報告で、いまだ未解明な課題が多い生体分子ナノマシンの世界の理解に大きく貢献するものです。この成果は1月22日に電子ジャーナルScientific Reports(サイエンティフィック・レポート;Nature publishing group)に掲載されました。

背景

大腸菌べん毛モーターのモデル図
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図1. 大腸菌べん毛モーターのモデル図
固定子であるMot複合体は、イオンチャネルとして機能し、チャネル中をイオンが通過するときにべん毛の回転子を回転させる駆動力を発生させると考えられています。Mot複合体は、4つのMotA型サブユニットと2つのMotB型サブユニットからなり、回転子の周りに8~12個埋め込まれています。

“回転している”という発見から45年近くたった細菌の運動器官であるべん毛(もう)の回転機構の詳細は、現在も解明されていません。べん毛モーターは、直径40nm(ナノメートル)程度の“ナノマシン”であり、細胞膜に埋め込まれていて、細胞膜を横切るプロトン(H+)やNa+など電気化学的駆動力(プロトン駆動力とナトリウムイオン駆動力という(※4))によってべん毛を回転させます。べん毛のモーターの駆動部は、回転子(かいてんし)と固(こ)定子(ていし)からなり(図1)、固定子であるMot(モット)複合体は、イオンチャネルとして機能し、チャネル中をイオンが通過するときにべん毛の回転子を回転させる駆動力を発生させると考えられています(つまり、固定子=エネルギー変換ユニットと考えることができます)。今回、報告するPaenibacillus sp. TCA20)(パエニバチルス・エスピー・TCA20)株(※5)は、湧き出る温泉中のカルシウムイオン量が牛乳並みに多く含まれている(約1740mg/リットル)神奈川県・秦野市の鶴巻温泉の温泉水より分離されました。
解析の結果、この微生物がもつべん毛モーターの固定子(TCA-MotAB1)は、これまで発見例のないCa2+やMg2+といった二価の陽イオンを利用してべん毛を回転させていることが分かりました。このような特徴は、この微生物が分離されたカルシウムイオンが豊富な環境にTCA20株の祖先が適応進化を遂げて獲得した形質であると考えられます。4年ほど前に「二価の陽イオンで駆動するモーターをもつ微生物が果たして自然界に存在するのか?」と半信半疑で本研究をスタートさせましたが、探していた微生物を発見できたことで、改めて自然と生命が作り出す地球上の進化の多様性の偉大さに驚かされます。

以下に本研究の研究結果を報告します。

研究方法の概要

初めに温泉水を分離源としてカルシウムイオンを添加した培地で菌株を複数分離後、カルシウムイオンを添加した場合のみ軟寒天培地(軟らかいゼリー状の培地)上で遊泳が確認できた株を1株分離しました。この菌株の簡易同定試験を行いPaenibacillus sp. TCA20株と命名しました(命名は、Toyo Univ.とCa2+とカルシウムの原子番号20からTCA20に由来します)。次にTCA20株の全ゲノム配列を次世代シークエンサーで解読し、べん毛モーター固定子をコードする遺伝子を同定しました。そして、この菌が2種類の固定子を持つことを突き止め、TCA-MotAB1とTCA-MotAB2と命名しました。これらのタンパク質の系統分類解析を行った結果、TCA-MotAB2は、プロトン(H+)で駆動するグループ、TCA-MotAB1は、機能未知な新規なグループに分類されることが分かりました(図2)。また、TCA20株は、生育に元素周期表の第2族元素に属するCa2+、Mg2+、ストロンチウムイオン(Sr2+)といった二価の陽イオンを要求するという特徴がありました(図3)。そこで、TCA-20株がCa2+、Mg2+、Sr2+といったイオンを利用して遊泳するのかを検証しました(図4)。次に、TCA20株での遺伝子操作技術が確立されていなかったことから、遺伝子操作の確立している好中性細菌の枯草菌(Bacillus subtilis)にTCA20株由来のmotAB1遺伝子(TCA-motAB1)を導入し、この株を用いて、遊泳速度の測定(図5)し、また、Mot複合体の特異的阻害剤の効果などの検証も行いました。最後に、このべん毛モーター固定子TCA-MotAB1を介して細胞内へMg2+が取り込まれているかを検証するため、枯草菌の主要なMg2+取り込み系を欠損させた株(生育に6mM以上のMg2+を必要とします)を用いて、TCA-MotAB1を発現させた場合にMg2+要求性が解消されるかを検討しました(図6)。また、その時の細胞内のMg2+濃度の測定も行いました。(図7)。

バチルス属(Bacillus)、パエニバチルス属(Paenibacillus)、オシアノバチルス属(Oceanobacillus)由来のMotB型、MotS型サブユニットのアミノ酸配列を利用した分子系統樹

赤字で示したものがTCA20株由来の2種類のMotB型固定子の位置を示しています。TCA20株には、H+で駆動するMotB型のクラスターに入るTCA20_MotB2とアノテーションによってMotBとなっていますが、H+で駆動する通常のMotB型のクラスターとは別のクラスターを形成するグループ(図中では、MotB?としています)があり、TCA20_MotB1は、このクラスターに分類されました。このグループの固定子は、微生物ゲノム解析などの遺伝情報がデータベースに登録されていますが、実際に実験からH+で駆動するMotB型であるという証拠はまだありません。

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図2.バチルス属(Bacillus)、パエニバチルス属(Paenibacillus)、オシアノバチルス属(Oceanobacillus)由来のMotB型、MotS型サブユニットのアミノ酸配列を利用した分子系統樹


図3

大腸菌と枯草菌は、二価の陽イオンを添加しなくても生育しますが、TCA20株は、培地中に二価の陽イオンが含まれていないと生育できません。これは、TCA20株の分離場所である鶴巻温泉の温泉水にカルシウムイオンが豊富に含まれているため、環境適応進化の過程でカルシウムイオン要求性になったと推定されます。TCA20株がカルシウムイオンの代わりに同じ第2族元素であるマグネシウムイオン(Mg2+)やストロンチウムイオン(Sr2+)に置き換えた場合でも生育を示すようになります。これは、他の微生物でもよく見られることですが、ことは、から、TCA20株の枯草菌は、Sr2+濃度をあげていくと生育阻害を受けることが分かります。枯草菌は、Sr2+濃度をあげていくと生育阻害を受けています。

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図3. Paenibacillus sp. TCA20株と好中性細菌の大腸菌と枯草(こそう)菌(きん)を各種二価カチオンを含んだ培地(pH7.7) で生育させた生育曲線


 

図4

測定には、30mM Tris-HCl(pH8.0)プラス5mMグルコースを含む緩衝液に塩化カルシウム(CaCl2)、塩化マグネシウム(MgCl2)または塩化ストロンチウム(SrCl2を添加したもので行いました。どのグラフでも、TCA20株は0mM濃度条件では、遊泳が観察されず、その後1mM濃度まで徐々に濃度を増加させると遊泳速度の増加(すなわち二価の陽イオン濃度に依存した遊泳)が観察されました。好アルカリ性細菌は、ナトリウムイオンが含まれていないため、どの濃度条件においても遊泳は観察されませんでした(二価の陽イオンを利用して遊泳はできないことを示しています)。また、大腸菌は、プロトン(H+)を利用して遊泳をするため、二価の陽イオン濃度に依存しない遊泳が観察されています。(すなわち、二価の陽イオン濃度が増えても遊泳速度の上昇は観察されません)。これまで、Paenibacillus sp. TCA20 (パエニバチルス・セスピ・TCA20)株のように二価の陽イオンを利用して運動している細菌は、発見されたことがなく、今研究成果が世界で初めて細菌が二価の陽イオンを利用して運動していることを示したことになります。

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図4. Paenibacillussp. TCA20株と大腸菌と好アルカリ性細菌(Bacillus pseudofirmus OF4株)の各種二価陽イオン濃度を変えた液体培地での遊泳速度結果


 

図5

図5(※クリックで拡大)

図5.枯草菌は、H+駆動型の固定子MotABとNa+駆動型の固定子MotPSを持ちます。枯草菌のmotAB遺伝子とmotPS遺伝子を欠損させたΔABΔPS株(運動性を示しません)を親株として、そこに、Paenibacillus sp. TCA20株由来のTCA-motAB1遺伝子とTCA-motAB2遺伝子をそれぞれ染色体上に組み込んだ株(それぞれTCA-AB1株とTCA-AB2株と命名)と枯草菌由来のmotAB遺伝子とmotPS遺伝子をそれぞれ染色体上に戻した株(それぞれBS-AB株(H+駆動型のコントロール)とBS-PS株(Na+駆動型のコントロール)を用いて、Mg2+濃度条件を変化させた緩衝液中における遊泳速度を測定しました。
この条件では、Na+が緩衝液中に含まれていないのでコントロールとして使用したBS-PSは、全く遊泳を示しませんでした。一方、もう一つのコントロールであるBS-ABは、環境中のH+を利用して遊泳することが可能なのでMg2+を含まない条件でも遊泳が観察されます。TCA-AB2株は、図2の分類解析でもプロトンで駆動する固定子に分類されていましたが、今回の結果より、H+で駆動することが示されました。また、データを示していませんが、H+型固定子阻害剤のCCCP(carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)に対しても感受性をしめしたことからそのことが裏付けされました。一方、TCA-AB1株は、Mg2+を含まない緩衝液での遊泳は観察されず、緩衝液中のMg2+濃度の上昇とともに遊泳速度の上昇が観察されました(で示した部分)。このことは、TCA-AB1株がMg2+を利用してべん毛を回転させていることを示唆しています。

 

 

図6

図6(※クリックで拡大)

図6.枯草菌の野生株と枯草菌の主要なMg2+取り込み系を破壊して生育にMg2+を6mM以上要求するようになった株からさらに2種類の固定子遺伝子(motAB, motPS)を欠損させた株(ΔABPSΔKQ株と命名、運動性なし)、それにPaenibacillussp. TCA20株由来のTCA-motAB1遺伝子を染色体上に組み込んだ株(ΔΔTCA-AB1株と命名)をMg2+濃度を制限した各種培地で37℃、9時間まで培養した。
主要なMg2+取り込み系を欠損しているΔABPSΔKQ株は、5mM-Mg2+条件では生育が見られず少なくとも6mM以上のMg2+を要求した。それに対して、ΔΔTCA-AB1株の生育は、野生株と同じような生育を示した。また、顕微鏡観察により運動性も確認された。このことから、ΔΔTCA-AB1株のべん毛は、Mg2+を駆動エネルギーとし、そのMg2+が細胞内へ流入することで生育が野生株のように回復していることが示唆された。次に、各条件での細胞内のMg2+濃度を測定した結果を図7に示します。

 

 

図7

図7(※クリックで拡大)

図7.ここでも図6で使用した菌株を用いて、37℃、9時間後に集菌した各菌体の細胞なMg2+濃度を測定した。その結果、ΔΔTCA-AB1株は、野生株と同程度の細胞内Mg2+濃度になっていることを確認できた。このことは、TCA-MotAB1固定子を介して細胞内へMg2+が流入したことを裏付ける結果となりました。

結果の概要

Paenibacillus sp. TCA20株のべん毛モーターの概略図
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図8.Paenibacillussp. TCA20株の
べん毛モーターの概略図

今回、発見されたべん毛モーター固定子は、これまでの固定子とは異なり、Ca2+やMg2+といった二価の陽イオンを共役イオンとして駆動するこれまで報告例のない新奇なモーターであることを明らかにしました。

●神奈川県・秦野市の鶴巻温泉よりカルシウムイオンで運動性を有する微生物、Paenibacillus sp. TCA20株を発見しました。

●TCA20株が持つべん毛モーター固定子TCA-MotAB1を枯草菌の主要なMg2+取り込み系を欠損させた株を使って解析した結果、この固定子は、Ca2+やMg2+といった二価の陽イオンを利用してべん毛モーターを駆動していることを明らかにしました。

●これまで、細菌のもつべん毛モーターで二価の陽イオンで駆動する報告例はなく世界初の成果を得ることができました。これらの結果を、模式的に表したものが、図8です。

考察と今後の展望

生物が持つ回転運動するモーターは、地球上で2種類のみが発見されているだけです。それらは、ATP合成酵素とべん毛モーターです。ATP合成酵素に関する研究では、1997年にイギリスのSir. John E. Walker博士とアメリカ合衆国のPaul D. Boyer博士がノーベル化学賞を受賞しています。45年以上前に発見されたべん毛モーターは、発見当時、その構造が人工のモーターと構造が類似しているということで人々に驚きを持って迎えられました。しかし、その回転機構の解明は、その大きさが約40ナノメートル(ナノは10億分の1)ということもあり困難を極め、最近の科学技術の進歩によってようやく研究が新たな段階にさしかかってきたところです。
TCA20株のべん毛モーター固定子TCA-MotAB1は、多量のCa2+が存在する生息環境に適応するためにCa2+が利用できるべん毛モーター固定子に進化したと推察されます。今回の二価の陽イオンで駆動する生体ナノマシンの発見は、生物の環境適応進化の分野やナノテクノロジーの分野からも重要な発見であると考えられます。この発見により、べん毛モーターでは、これまでの3種類の駆動力エネルギー(H+,Na+,K+)以外に二価の陽イオン(Ca2+, Mg2+)を利用できる設計図(アミノ酸配列情報)を得たことになります。今後は、この情報を利用しながらどのように利用するイオンを選別しているのか?その選択フィルターの仕組みを明らかにすることで、ヒトの手により自由なエネルギーを使い分けられる人工的なナノマシンや分子スイッチの創成が可能になると考えられます。今後は、このような応用研究を進めていく予定です。

脚注

※1:細菌のべん毛モーター

細菌のべん毛モーターはATPの化学エネルギーではなく、H+、Na+またはK+の電気化学的エネルギーが直接使われていると説明されてきました。べん毛のモーターの駆動部は、回転子と固定子からなり(図1)、固定子であるMot複合体は、イオンチャネルとして機能し、チャネル中をイオンが通過するときにべん毛の回転子を回転させる駆動力を発生させると考えられています。Mot複合体は、4つのMotA型サブユニットと2つのMotB型サブユニットからなり、回転子の周りに8~16個の固定子が埋め込まれていることが報告されています。(図1)。原生生物がもつ鞭毛モーターは、ATPの化学エネルギーを利用しています。細菌のもつべん毛は、原生生物の鞭毛(べんもう)と区別するために慣用的に「べん毛(もう)」と書かれることもあります。

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※3:極限環境微生物

地球上には非常に苛酷な極限環境-たとえば、砂漠、火山、温泉源、高濃度の塩湖、深海など-が存在し、こうした環境は生物にとって生育に不利であると考えられてきました。しかし、近年、このような極限環境にも多様な微生物{好熱菌、低温菌、好塩菌、好酸性菌、好アルカリ性菌、嫌気性菌、好圧菌、好乾燥性菌、放射能耐性菌、溶媒耐性菌、重金属耐性菌、人工化学物質(ダイオキシン、PCB等)分解菌など}が存在することが明らかになってきました。このような微生物の総称を極限環境微生物といいます。

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4:プロトン駆動力とナトリウム駆動力

※4図プロトン駆動力は膜を介して正の電荷をもったH+が移動するので、イオンの移動による膜電位の形成(電気エネルギー)とH+の濃度勾配(化学的エネルギー)の二成分からなり(図参照)、下記の式で表わされる電気化学的なエネルギーを指します。ナトリウム駆動力の場合は、[H+]が[Na+]に置き換わったものです。

ΔμH+FΔP =ΔΨ -pH; Z=2.3RTF

ΔP:プロトン駆動力(mV単位)
ΔpH:細胞内pH-細胞外pH
Z:36℃で60mV
:絶対温度
R:気体定数
F:ファラデー定数

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※5 Paenibacillussp. TCA20(パエニバチルス・セスピー・ティシーエイ20)株

Paenibacillus sp. TCA20株の電子顕微鏡写真
Paenibacillus sp. TCA20株の
電子顕微鏡写真
(細胞から複数のべん毛が
生えていることが分かる)

Paenibacillus属細菌は、通性嫌気性の胞子形成細菌です。昔はBacillus(バチルス)属に分類されていましたが、バチルス属から分かれる形で新たに命名された属です。Paeneというalmostを意味するラテン語からついた属名で、土壌、根圏環境、飼料、昆虫の幼虫、口腔内からも分離された例があります。Paenibacillus vortex(パエニバチルス・ボルテックス)は、イスラエルの研究者によって研究された報告が「最も賢い細菌」として2011年9月号の日経サイエンスに紹介されています。

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備考

プロフィール

伊藤政博 いとう・まさひろ

伊藤政博教授写真東洋大学生命科学部生命科学科 教授。

博士(工学)。1994年、東京工業大学大学院理工学研究科博士後期課程修了後、米マウントサイナイ医科大学に勤務。2009年から現職。2011年「ハイブリッド型細菌べん毛モーターに関する研究」で日本学術振興会賞(生物系)を受賞。

 

論文発表の概要

研究論文:

  A novel type bacterial flagellar motor that can use divalent cations as a coupling ion

論文著者:

  Riku Imazawa, Yuka Takahashi, Wataru Aoki, Motohiko Sano & Masahiro Ito

公表雑誌:

  電子ジャーナル
  『Scientific Reports(サイエンティフィック・レポート;Nature publishing group) 』 
    (2016年1月22日掲載)

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